1929 m. gegužės 4 d. Briuselyje. Per Antrąjį pasaulinį karą jos motina, olandų baronienė Ella Van Heemstra, pakeitė dukters pavardę į Eddą Van Heemstrą, kad užmaskuotų britišką kilmę. A. Hepburn tėvas Josephas Victoras Anthony Rustonas turėjo angliškų ir austriškų šaknų. Jis savo pavardę pasikeitė į Hepburn-Rustono, mat manė, kad yra anglų grafo Jameso Hepburno palikuonis. Šeimą A. Hepburn tėvas paliko, kai mergaite buvo šešeri.
Vaikystėje A. Hepburn mokėsi Anglijoje veikusiame pensione, tačiau per Antrąjį pasaulinį karą gyveno nacių okupuotoje Olandijoje. Nors iš pradžių motina ėmė demonstruoti naciams palankumą, kai buvo suimtas ir nužudytas A. Hepburn dėdė, ji su dukterimi pabėgo į gretimą miestą ir netrukus prisijungė prie pasipriešinimo rėmėjų.
A. Hepburn savanoriavo ligoninėje, į kurią buvo pristatomi sužeisti Sąjungininkų kariai. Kadangi buvo pramokusi baleto, A. Hepburn dalyvaudavo šokių pasirodymuose, o už juos gautus pinigus skirdavo pasipriešinimo judėjimui paremti. Kartais A. Hepburn pasitarnaudavo kaip kurjeris, perduodantis pranešimus su naciais kovojančioms grupuotėms.
Pirmas A. Hepburn vaidmuo kine buvo titruose netgi nepaminėtas pasirodymas 1951-aisiais pastatytame filme „One Wild Oat“. Tais pačiais metais A. Hepburn sušmėžavo ir kino juostoje „Levanderio kalvos šutvė“ („The Lavender Hill Mob”), kurio ryškiausia žvaigždė – Alecas Guinnessas. Pirmąjį ryškų vaidmenį aktorei atnešė pjesės „Gigi“ pastatymas Brodvėjuje 1951-aisiais. 1958-aisiais ši pjesė buvo pritaikyta kino ekranui, tačiau tada pagrindinis vaidmuo buvo patikėtas kitai aktorei – Leslie Caron.
Kartą per Monte Karle vykusį filmavimą A. Hepburn pastebėjo prancūzų rašytoje Colette. Ji panoro, kad jaunoji A. Hepburn suvaidintų pagrindinę veikėją jos romano „Gigi“ pastatyme. Štai kaip 22-ejų metų A. Hepburn pateko į 1951-aisiais debiutavusio sceninio veikalo kūrėjų komandą.
Už vaidmenį filme „Atostogos Romoje“ A. Hepburn buvo įtekta „Oskaro“ statulėlė. Šioje 1953-iaisiais pasirodžiusioje juostoje aktorė įkūnijo princesę Anną, trumpam pabėgančią nuo karališkųjų pareigų. A. Hepburn partneris šiame filme – aktorius Gregory Peckas. Jam atiteko reporterio vaidmuo.
1954-aisiais debiutavęs šou „Ondine“ tapo paskutiniu A. Hepburn pasirodymu Brodvėjaus scenoje. Jis atnešė aktorei Tony apdovanojimą kaip geriausiai pagrindinio vaidmens atlikėjai. Ruošiant pastatymą A. Hepburn teko bendradarbiauti su Melu Ferreru. Tų pačių metų rugsėjį aktoriai Šveicarijoje susituokė.
1956-aisiais su savo vyru Melu Ferreru A. Hepburn pasirodė ekranizuotoje „Karo ir taikos“ versijoje, o 1959-aisiais ji suvaidino įžadų sunkiai gebančią laikytis vienuolę dramoje „Vienuolės istorija“ („The Nun‘s Story“). Už pastarąjį vaidmenį A. Hepburn buvo nominuota „Oskarui“.
1960-aisiais A. Hepburn susilaukė pirmo vaiko – sūnaus Seano. Paskesnis jos nėštumas baigėsi nesėkme – šeštą mėnesį įvykusiu persileidimu. Antro sūnaus Lucos A. Hepburn susilaukė 1970-aisiais.
A. Hepburn vizitine kortele tapusiu darbu galima pavadinti Holly Golightly vaidmenį 1961-aisiais išėjusiame filme „Pusryčiai pas Tifanį“, kurio siužeto pagrindu tapo to paties pavadinimo Trumano Capote romanas. Po šio vaidmens A. Hepburn ketvirtą kartą buvo nominuota „Oskarui“. Minėtina, kad T. Capote nepritarė sprendimui pasirinkti A. Hepburn: jisai norėjo, kad tas vaidmuo atitektų Marilyn Monroe.
O štai kompozitorius Henry Mancini pareiškė, kad garsiąją dainą „Moon River“ parašė būtent A. Hepburn. Aktorės suvaidinta herojė Holly Golightly kaip tik tą dainą ir dainuoja siekdama sužavėti kaimynystėje apsigyvenusį rašytoją (aktorius George‘as Peppardas). Anot H. Mancini, iš visų jo išklausytų „Moon River“ atlikimo versijų pati puikiausia buvo ta, kurią pateikė A. Hepburn.
Elizos Doolittle vaidmuo 1964-aisiais pasirodžiusioje juostoje „Mano puikioji ledi“ tapo daugiausia prieštarų sukėlusiu A. Hepburn darbu. Plačioji publika norėjo, kad vaidmuo atitektų Julie Andrews, pasirodžiusiai Brodvėjaus pateiktoje kūrinio versijoje. A. Hepburn dainavimą filme dubliavo dainininkė Marni Nixon. Vėliau aktorė prisipažino, kad nebūtų sutikusi filmuotis, jei tik būtų žinojusi, kad prodiuseris Jackas Warneris nepageidauja girdėti jos dainavimo.
1967-aisiais, darbuojantis prie filmo „Two for the Road“, A. Hepburn partneriu tapo Albertas Finney. Vėliau tais pačiais metais aktorė penktą kartą atsidūrė tarp pretendentų į „Oskarą“. Tokio apdovanojimo galbūt vertu jos darbu pasirodė aklos moters vaidmuo trileryje „Palauk iki sutems“ („Wait Until Dark“).
1968-aisiais A. Hepburn ir M. Ferrero santuoka iširo, o 1969-aisiais aktorė ištekėjo už italų psichiatro Andrea Dotti. Ši santuoka taip pat netvėrė iki „mirtis išskirs“: 1982-aisiais pora išsiskyrė. Nuo 1980-ųjų iki gyvenimo pabaigos aktorės partneriu buvo Robertas Woldersas, olandų aktorius, buvęs aktorės Merle Oberon sutuoktinis.
1989-aisiais A. Hepburn tapo UNICEF Gerosios valios ambasadore. Eidama šias pareigas A. Hepburn sudalyvavo daugiau nei pusšimtyje įvairiose pasaulio šalyse inicijuotų UNICEF projektų. Neretai pavojingos kelionės po pasaulį leido ekrano žvaigždei iš arti pamatyti pažeidžiamiausias bendruomenes ir vargingiausiai auginamus vaikus. A. Hepburn siekė atkreipti išsivysčiusių šalių visuomenės dėmesį didelio masto humanitarines krizes.
1959-aisiais A. Hepburn atmetė pasiūlymą imtis pagrindinio vaidmens Anos Frank „Dienoraščio“ adaptacijoje, mat manė, kad tokiam darbui yra per sena. Daug vėliau, 1990-aisiais, tam tikras dienoraščio ištraukas kompozitorius Michaelas Tilsonas Thomasas priderino prie savo simfoninės muzikos, o A. Hepburn jis pasirinko kaip pačią verčiausią jų skaitovę. Netrukus buvo surengtas skaitymų su simfoninės muzikos pritarimu turas po Jungtines Valstijas ir Angliją. Už koncertus gautos lėšos buvo pervestos UNICEF.
Paskutine A. Hepburn, kaip UNICEF ambasadorės, kelione tapo misija į Somalį 1992-ųjų rugsėjo mėnesį. Kai grįžo iš kelionės, aktorė ėmė skųstis skrandžio skausmas, o po poros mėnesių jai buvo diagnozuotas vėžys.
A. Hepburn mirė 1993 m. sausio 20 d. savo namuose Šveicarijoje.